El principio de la transferencia Western es el siguiente:
La transferencia Western es una tecnología de análisis de proteínas de uso común que separa las proteínas objetivo de mezclas complejas y las detecta cuantitativamente para determinar la presencia y existencia de nivel de expresión de las proteínas. La tecnología de transferencia Western incluye pasos como la preparación de muestras, la separación de proteínas, la transferencia a membrana y la detección y análisis de proteínas.
1. Preparación de muestras y separación de proteínas
En primer lugar, la proteína objetivo debe extraerse de las células o tejidos. Generalmente se utilizan kits de lisis celular y extracción de proteínas para destruir la membrana celular y. liberar la proteína. Luego, la muestra extraída se purifica y se enriquece mediante pasos como la centrifugación para eliminar impurezas e interferencias de otras proteínas.
2. Electroforesis en gel SDS-PAGE
Separar las proteínas de la muestra según su peso molecular es un paso clave en el Western blot. Para este fin se suele utilizar la electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). En SDS-PAGE, una muestra de proteína se somete a electroforesis para migrar en un gel y separarse en diferentes bandas según diferentes pesos moleculares.
3. Transferencia a la membrana
Una vez completada la separación por SDS-PAGE, es necesario transferir la proteína del gel a la membrana para su posterior inmunodetección. Este paso se llama transferencia electroforética y generalmente utiliza un horno semiseco o un sistema de transferencia húmeda.
Las proteínas se transfieren desde el gel a la membrana aplicando una corriente eléctrica a la proteína. Las membranas de transferencia comúnmente utilizadas incluyen la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y la membrana de nitrocelulosa.
4. Detección y análisis de proteínas
Después de que la proteína se transfiere a la membrana, es necesario realizar la detección y el análisis de proteínas. El primer paso es el bloqueo, es decir, el uso de inhibidores de unión a proteínas para bloquear sitios de unión no específicos en la membrana para evitar interferencias de fondo en los inmunoensayos. El segundo paso es la inmunodetección, donde los anticuerpos específicos se combinan con la proteína objetivo y se detectan mediante anticuerpos secundarios marcados o anticuerpos marcados con enzimas.
5. Análisis de resultados y adquisición de datos
La información sobre la presencia y el nivel de expresión de las proteínas se puede obtener mediante Western blot. Esto se puede determinar observando bandas de proteínas en los resultados de los inmunoensayos. Adquiera imágenes utilizando un sistema de imágenes (como un sistema de quimioluminiscencia o un sistema de imágenes UV) y realice análisis cuantitativos utilizando software de análisis de imágenes.