Enzimoinmunoensayo Enzimoinmunoensayo (en adelante ELISA): es la tecnología más utilizada en la tecnología de inmunoensayo enzimático. El método básico consiste en adsorber un antígeno o anticuerpo conocido en la superficie de un vehículo en fase sólida (placa de microrreacción de poliestireno), permitir que la reacción antígeno-anticuerpo marcada con enzima se desarrolle en la superficie de la fase sólida y utilizar un método de lavado para eliminarlo. eliminar los componentes libres en la fase líquida. Los métodos ELISA comúnmente utilizados incluyen el método sándwich de doble anticuerpo y el método indirecto. El primero se usa para detectar antígenos macromoleculares y el segundo se usa para determinar anticuerpos específicos. Desde que Engvall y Perlman (1971) informaron por primera vez sobre el establecimiento de ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), ELISA se ha desarrollado rápidamente y se ha utilizado ampliamente debido a sus ventajas de rapidez, sensibilidad, simplicidad y facilidad de estandarización. Aunque los primeros ELISA no eran lo suficientemente específicos, lo que dificultaba su aplicación práctica, con la mejora continua de los métodos y la continua actualización de los materiales, especialmente el uso de métodos de ingeniería genética para preparar antígenos recubiertos, el uso de métodos específicos de antígenos ha aumentado. Las pruebas ELISA que utilizan varios anticuerpos monoclonales han mejorado enormemente la especificidad de ELISA. Además, el uso de detectores ELISA altamente computarizados ha hecho que ELISA sea más conveniente, práctico y estandarizado, convirtiéndolo en uno de los métodos de detección más utilizados. En la actualidad, el método ELISA se ha utilizado ampliamente en el diagnóstico de diversas enfermedades bacterianas y virales. En términos de cuarentena animal, ELISA ha sido un método estándar ampliamente utilizado en el diagnóstico de gastroenteritis transmisible porcina, paratuberculosis bovina, rinotraqueítis infecciosa bovina, pseudorrabia porcina, lengua azul, etc. (1) Principio básico El principio básico del método ELISA es que la molécula de enzima se une al anticuerpo o molécula de antianticuerpo de una manera altamente valerosa. Esta combinación no cambiará las propiedades inmunológicas del anticuerpo ni afectará las biológicas. actividad de la enzima. Dichos anticuerpos marcados con enzimas pueden unirse específicamente a antígenos o anticuerpos adsorbidos en vehículos en fase sólida. Después de agregar gota a gota la solución de sustrato, el donante de hidrógeno contenido en el sustrato puede cambiar de la forma reducida incolora a la forma oxidada coloreada bajo la acción de la enzima, lo que resulta en una reacción de color. Por lo tanto, la reacción de color del sustrato se puede utilizar para determinar si existe una reacción inmune correspondiente. La profundidad de la reacción de color es directamente proporcional a la cantidad del anticuerpo o antígeno correspondiente en la muestra. Esta reacción de color puede medirse cuantitativamente mediante un detector ELISA, que combina la sensibilidad de la reacción química enzimática con la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo, lo que convierte al método ELISA en un método de detección específico y sensible. (2) Enzimas utilizadas para marcar Las enzimas utilizadas para marcar anticuerpos o antianticuerpos deben tener las siguientes características: alta actividad y sensibilidad; productos de reacción estables que sean fáciles de visualizar y puedan producirse comercialmente; Actualmente se utilizan ampliamente la peroxidasa de rábano picante (HRP), la fosfatasa alcalina, la glucosa oxidasa, etc., entre las cuales la HRP es la más utilizada. 1. Peroxidasa de rábano picante (HRP) La peroxidasa se distribuye ampliamente en las plantas, con el mayor contenido en el rábano picante (HRP) extraída del rábano picante, una proteína enzimática incolora (contenido de azúcar del 18%) compuesta de porfirina de hierro de color marrón oscuro. El peso molecular es de aproximadamente 40.000. Está compuesto por aproximadamente 300 aminoácidos. El punto isoeléctrico es de pH 3-9. El valor de pH óptimo para la reacción catalítica se debe a que existen ligeras diferencias según el donante de hidrógeno, generalmente alrededor de 5. . Esta enzima es soluble en agua y soluciones de sulfato de amonio por debajo del 50% de saturación. Los espectros de absorción máxima de la proteína enzimática y del grupo protésico son 275 nm y 403 nm respectivamente. La pureza de la enzima se expresa mediante RZ: RZ=OD403/OD275. El RZ de la enzima pura está en su mayoría por encima de 3,0, siendo el más alto 3,4. Los productos enzimáticos con un RZ inferior a 0,6 son enzimas crudas, donde las proteínas no enzimáticas representan aproximadamente el 75 % y no se pueden utilizar para el etiquetado. Sólo se pueden utilizar para marcar aquellos con RZ superior a 2,5.
El sustrato de HRP es el peróxido de hidrógeno. Hay varios donantes de hidrógeno durante la reacción catalítica: (1) o-fenilendiamina (OPD) El producto es de color naranja, soluble y altamente sensible. El valor de absorción máximo es de 490 nm. A simple vista, la reacción se detiene fácilmente con ácido sulfúrico concentrado y el color no cambia en varias horas. Actualmente es el ELISA más utilizado en China (2) dianisidina (OD); amarillo anaranjado, con un valor de absorción máximo de 400 nm, el color es relativamente estable (3) ácido 5-aminosalicílico (5-AS): el producto es de color marrón oscuro, el valor de absorción máximo está a 449 nm, parcialmente disuelto y el la sensibilidad es pobre (4) o-Toluidina (OT) El producto es azul, con un valor máximo de absorción a 630 nm, parcialmente disuelto, inestable y no resistente a los ácidos, pero reacciona rápidamente y tiene un color evidente. 2. La fosfatasa alcalina se extrae de la mucosa intestinal de los terneros y de Escherichia coli y consta de múltiples isoenzimas. Existen muchos tipos de sustratos para ellos, el más utilizado es el fosfato de nitrobenceno, que es económico y no tóxico. El producto de hidrólisis enzimática es amarillo, soluble y tiene un valor máximo de absorción a 400 nm. La actividad de la enzima se basa en la hidrólisis de 1 μg de fenilfosfato disódico a 37°C durante 1 minuto en un sistema de reacción de pH 10. (3) Método de etiquetado enzimático de anticuerpos y determinación del efecto de etiquetado 1. Método de etiquetado Un buen conjugado enzimático depende de dos condiciones: un anticuerpo de alto título y una enzima de alta actividad. La actividad y la pureza del anticuerpo son fundamentales para preparar anticuerpos marcados porque la respuesta inmune específica aumenta al aumentar la actividad y la pureza del anticuerpo. Durante el proceso de etiquetado enzimático, la actividad del anticuerpo se reduce, por lo que se requiere globulina de anticuerpo con alta pureza, título alto y fuerte afinidad por el antígeno. Lo mejor es utilizar cromatografía de afinidad.