El experimento WB consiste en separar la muestra de proteína mixta mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), utilizar un sifón especial o un dispositivo de campo eléctrico para transferirla a un medio de fase sólida (como una membrana de PVDF) y luego Utilice un vehículo en fase sólida para que la proteína o el péptido actúe como antígeno.
Se une específicamente al primer anticuerpo correspondiente y luego se combina con la enzima o el segundo anticuerpo marcado con isótopos y finalmente detecta la expresión del gen objetivo específico mediante el desarrollo del color del sustrato o la autorradiografía de los ingredientes proteicos.
El principio experimental y el diagrama de flujo de wb son los siguientes:
Preparación de la muestra de proteínas:
La muestra original puede ser células, tejido, sobrenadante de cultivo, inmunoprecipitación o Para las proteínas purificadas por afinidad, el siguiente es el método de procesamiento de muestras celulares para la detección cualitativa de proteínas objetivo. Para los métodos de preparación de muestras restantes, consulte la literatura relevante.
Notas:
1. Mezcle los dos reactivos A y B en volúmenes iguales en una envoltura de plástico, después de 1 minuto, coloque la proteína de la membrana hacia abajo en pleno contacto con la mezcla; 1 minuto, pasar la película a otro film transparente, retirar el líquido restante, envolverla bien y colocarla en un portapelículas de rayos X.
2. En el cuarto oscuro, vierta 1× revelador y fijador en bandejas de plástico respectivamente; saque la película de rayos X bajo la luz roja y córtela al tamaño apropiado (más larga que la película) con un cortador de papel. Tanto el ancho como el ancho deben ser 1 cm más grandes).
Abra el soporte de la película de rayos X y coloque la película de rayos X sobre la película. Una vez colocada, no se puede mover. Cierre el soporte de la película de rayos X y comience a ajustar la exposición de forma adecuada. la intensidad de la señal. El tiempo suele ser de 1 minuto o 5 minutos. También puede optar por presionar la película varias veces en diferentes momentos para lograr el mejor efecto, abra el soporte de la película de rayos X y tome. Saque la película de rayos X y sumérjala rápidamente en el revelador. Espere hasta que Detenga el revelado inmediatamente después de que las bandas se vuelvan evidentes.
El tiempo de desarrollo es generalmente de 1 a 2 minutos (20 a 25 °C). Cuando la temperatura es demasiado baja (menos de 16 °C), el tiempo de desarrollo debe extenderse adecuadamente después del desarrollo; sumerja inmediatamente la película de rayos X en el fijador, el tiempo de fijación es generalmente de 5 a 10 minutos, hasta que la película sea transparente; enjuague el fijador restante con agua del grifo y seque a temperatura ambiente.