Estudio de caso de ChIP-Seq
Ellen Markljung y otros utilizaron la tecnología ChIP-Seq para descubrir: una base única en el tercer intrón del gen IGF2 del cerdo doméstico (que codifica un crecimiento similar a la insulina factor 2) La sustitución de la base G→A conduce a la pérdida del sitio de unión del factor inhibidor ZBED6 en este gen, regulando así la expresión de IGF2 en el músculo esquelético (el nivel de expresión es 3 veces mayor que en condiciones normales). La mutación afecta principalmente al crecimiento muscular (aumenta la cantidad de músculo esquelético, aumentando así la producción de carne de cerdo de 3 a 4), agrandando el corazón y la deposición de grasa.
Gen ZBED6 y proteína ZBED6
Gen ZBED6: Es un transposón que ha perdido su función de transposición. Se localiza en el primer intrón del gen ZC3H11A en todos los mamíferos; Está altamente conservado en ratones, ratas, humanos, orangutanes, perros, caballos y cerdos domésticos. El análisis de PCR en tiempo real mostró que el ARNm de Zbed6 de ratón se expresaba en diversos grados en los tejidos del cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, músculo, ovario, bazo, cola y testículo.
Se reporta por primera vez la proteína ZBED6. La proteína ZBED6 contiene 2 dominios BED y 1 dominio de dimerización hATC; los residuos de aminoácidos 61 a 80 y 231 a 248 son dos señales de localización nuclear (segmento rico en Lys-Arg, KKKRKKGLRIKGKRRRKKLI). Esta proteína está altamente conservada entre los mamíferos, especialmente el dominio BED de unión al ADN, que muestra ~100 similitudes en 26 especies (incluidos los cerdos domésticos).
La proteína ZBED6 actúa como un factor inhibidor para regular la expresión génica.
Resultados experimentales relevantes después de utilizar ARNip para silenciar el gen Zbed6 en mioblastos C2C12 de ratón confirmaron que la proteína ZBED6 actúa como un factor inhibidor. El factor inhibe la expresión del gen Igf2 uniéndose al sitio QTN (nucleótido de rasgo cuantitativo) ubicado en el tercer intrón del gen Igf2. Cuando se silencia el gen Zbed6, aumenta la expresión del gen Igf2, se acelera la proliferación celular (formación de miotubos) y se acelera la cicatrización de heridas.
Para estudiar el objetivo de la proteína ZBED6 (gen Igf2 y sus genes posteriores), el autor utilizó la tecnología ChIP-Seq para analizar mioblastos C2C12 de ratón. Secuenciación AB SOLiD obtenida:
① 24 millones de lecturas (alineadas con el genoma del ratón), 2.499 Picos la mayoría de los picos (Peaks) se concentran en el sitio QTN en el intrón del gen Igf2; El sitio QTN es el principal sitio de unión de la proteína ZBED6 en el genoma (Figura 1).
El análisis de anotaciones ②GO encontró que 1200 objetivos de la proteína ZBED6 desempeñan funciones en el desarrollo, la regulación transcripcional y la diferenciación celular (Figura 2). Entre ellos, 262 genes diana codifican factores de transcripción, 36 contienen dominios Homeobox, 26 pertenecen a la familia bHLH (basic helix-loop-helix), 10 pertenecen a la familia FOX, 8 receptores nucleares y 7 pertenecen a la familia SOX (Figura 3).
En resumen, los efectos fenotípicos, la alta conservación de la secuencia, la localización nuclear, la extensa distribución tisular y muchos genes diana de los mioblastos C2C12 en cerdos domésticos con mutaciones del gen IGF2 y mioblastos C2C12 de ratón con silenciamiento del gen Zbed6 tienen importantes ventajas. Funciones biológicas. Esta serie de fenómenos muestra que en los mamíferos, ZBED6 es un factor de transcripción importante que afecta el desarrollo, la proliferación celular y el crecimiento.
Figura 1 Resultados de ChIP-Seq de células C2C12 de ratón (A) Distribución máxima de ChIP-Seq del sitio QTN en el intrón del gen Igf2
Figura 2 Resultados de ChIP-Seq de células C2C12 de ratón (E) Clasificación de ontología genética
Figura 3 Resultados de ChIP-Seq de células C2C12 de ratón (F) Familia de factores de transcripción unidos por la proteína ZBED6