Utilizar IPTG para inducir la expresión de la proteína diana a. Las condiciones de expresión se optimizaron y las condiciones de inducción se ajustaron a 37°C. Después del análisis, la proteína diana estaba principalmente en forma de cuerpos de inclusión. Por lo tanto, la proteína objetivo a se redisuelve mediante desnaturalización y renaturalización, y la proteína objetivo se obtiene mediante purificación por afinidad en columna de Ni.
Análisis de los resultados de identificación de la expresión de proteínas
IPTG indujo la expresión de proteínas y, después del análisis SDS-PAGE al 12 %, la proteína diana existía principalmente en el precipitado y los resultados se muestran en la figura
Figura 1 Análisis SDS-PAGE de identificación de expresión de proteínas
Fig.1 Análisis de expresión SDS-PAGE
M: Estándar de masa molecular de proteínas
1: No disponible Inducción
2: Después de la inducción
3: Sobrenadante después de la inducción y fragmentación
4: Precipitado después de la inducción y fragmentación
Desnaturalización de la proteína del cuerpo de inclusión
1. Resuspender el sedimento bacteriano en 20 ml de solución de lisis (Tris-HCl 20 mM que contiene PMSF 1 mM y cóctel de inhibidor de proteasa bacteriana, pH 8,0) y interrumpir por sonicación (potencia 400 W, trabajo durante 4 segundos, pausa de 8 segundos, ***20 minutos);
2. Centrifugar el lisado celular ultrasonicado a 10.000 g durante 20 minutos a 4°C para recolectar el precipitado;
3. Utilice la inclusión Lave los cuerpos de inclusión 3 veces con una solución de lavado corporal (Tris 20 mM, EDTA 1 mM, urea 2 M, NaCl 1 M, Triton X-100 al 1 %, pH 8,0);
4. Usar tampón de lisis (Tris 20 mM, DTT 5 mM, urea 8 M (pH 8,0), disolver los cuerpos de inclusión en una determinada proporción y colocar a 4 °C durante la noche; centrifugar a 15000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente. ;
5. Agregue Tris-HCl 20 mM gota a gota a la solución anterior, tampón NaCl 100 mM, pH 8,0, duplicando gradualmente la dilución del gradiente con agitación lenta. Coloque la solución de proteína en una bolsa de diálisis y. dializar durante la noche en solución de Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0.
Purificación por afinidad en columna de Ni de proteínas de fusión de cuerpos de inclusión y análisis de resultados
Purificación en columna de Ni de proteínas de cuerpos de inclusión
1. Utilice un sistema de cromatografía de baja presión para purificar cuerpos de inclusión La solución se cargó en la columna de cromatografía de afinidad Ni-IDA-Sepharose CL-6B preequilibrada con Ni-IDA Binding-Buffer a un caudal de 0,5 ml/min;
2. Uso Ni-IDA Binding-Buffer to Wash a un caudal de 0,5 ml/min hasta que el valor OD280 del efluente alcance la línea base;
3. Utilice Ni-IDA Washing-Buffer (Tris-HCl 20 mM , imidazol 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 8,0) Enjuague a un caudal de 1 ml/min hasta que el valor de OD280 del efluente alcance la línea base
4. Utilice tampón de elución Ni-IDA; (Tris-HCl 20 mM, imidazol 250 mM, NaCl 0,15 M, pH 8,0) Eluir la proteína objetivo a un caudal de 1 ml/min y recoger el efluente
5. Añadir lo recogido anteriormente; solución de proteína a la bolsa de diálisis, use Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 8,0 Dialice durante la noche;
6. Realice un análisis SDS-PAGE al 12 % y los resultados se muestran en la Fig. 2.
Análisis de los resultados de la purificación
El cuerpo de inclusión se desnaturaliza y renaturaliza, la proteína objetivo se resolubiliza y la proteína objetivo se obtiene mediante purificación por afinidad en columna de Ni y luego se analiza al 12%. PÁGINA SDS.
Figura 2 Análisis SDS-PAGE de purificación de proteínas
Fig.2 Análisis SDS-PAGE de purificación de proteínas de fusión
M: Estándar de masa molecular de proteínas
1: Procesamiento de la muestra después de la trituración
2: Flujo
3: Elución
Método Western Blot para detectar la renaturalización de cuerpos de inclusión
(1) Cargue 5 μl de muestra
(2) Después de cargar el gel de poliacrilamida, primero ejecute el gel de apilamiento a 90 V, luego aumente el voltaje a 200 V hasta el final de la electroforesis.
(3) Después de la electroforesis, retire el gel y transfiera la membrana a un voltaje constante de 100 V, lo que demora aproximadamente 1,5 horas, y una corriente constante de 250 mA
(4 ) Fin de la electrotransferencia Finalmente, retirar la membrana y lavarla 4 veces con PBST, 5 minutos cada vez.
(5) Bloquear la membrana en solución bloqueadora de leche desnatada en polvo al 5% a 37°C durante 1 hora.
(6) Diluir el anticuerpo primario con solución bloqueadora y mantener la membrana en el diluyente del anticuerpo primario a 4°C durante la noche.
(7) Retire la membrana al día siguiente y lávela 4 veces con PBST, 5 minutos cada vez.
(8) Diluya el anticuerpo secundario con una solución bloqueadora que contenga un 5%. leche. La membrana se hizo reaccionar en anticuerpo secundario a 37°C durante 1 h.
(9) Una vez completada la reacción, saque la membrana, colóquela en una caja limpia y lave la membrana 4 veces, 5 minutos cada vez.
(10) Evolución y exposición de ECL.
Análisis de resultados de Western Blot
Proporción de dilución de anticuerpos primarios y secundarios:
Proporción de dilución del nombre del anticuerpo número Proporción de dilución del nombre del anticuerpo secundario
1His1 : 1000 cabra anti-conejo 1: 5000
Figura 3 Análisis de identificación de proteínas mediante Western Blot
Fig.3 Análisis de Western Blot de purificación de proteínas de fusión
M: Estándar de masa molecular de proteína
1: Muestra purificada
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