Regulación a nivel transcripcional de la expresión de genes eucariotas
Existen las siguientes diferencias entre células eucariotas y células procarióticas en términos de transcripción genética, traducción y estructura espacial del ADN:
1. En las células eucariotas, una cadena de ARNm madura sólo puede traducirse en una cadena polipeptídica. La forma de operón multigénico común en los procariotas es relativamente rara en las células eucariotas.
2. Las histonas del ADN de las células eucariotas se combinan con una gran cantidad de proteínas no histonas, y sólo una pequeña parte del ADN está desnuda.
3. La mayor parte del ADN en las células eucariotas superiores no se transcribe. En las células eucariotas, hay una parte de la secuencia de ADN que consta de varias o docenas de bases, que se repite cientos de veces o incluso más. a lo largo del genoma millones de veces. Además, existen intrones no traducidos en los genes de la mayoría de las células eucariotas.
4. Los eucariotas pueden reorganizar fragmentos de ADN de forma ordenada según las necesidades de las etapas de crecimiento y desarrollo, y también pueden aumentar el número de copias de ciertos genes en las células cuando sea necesario. Esta capacidad es única entre los procariotas. Extremadamente raro.
5. En los procariotas, las regiones reguladoras de la transcripción son muy pequeñas y la mayoría de ellas están situadas no muy aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción. La unión de las proteínas reguladoras a los sitios reguladores puede promover o inhibir directamente. ARN polimerasa. su combinación. En los eucariotas, las regiones reguladoras de la transcripción genética son mucho más grandes y pueden estar a cientos o incluso miles de pares de bases del promotor central. Aunque estas regiones reguladoras también pueden unirse a proteínas, no afectan directamente la aceptabilidad de la región promotora de la ARN polimerasa, pero afectan su interacción con la ARN polimerasa al cambiar la configuración del ADN de toda la región 5' aguas arriba del gen controlado. talento.
6. El ARN eucariota se sintetiza en el núcleo y sólo puede traducirse en proteína tras su transposición a través de la membrana nuclear y alcanzar la matriz citoplasmática. Una separación espacial tan estricta no existe en los procariotas.
7. Muchos genes eucarióticos sólo pueden traducirse con éxito en proteínas después de someterse a complejos procesos de maduración y empalme.
Los elementos básicos de la regulación de la transcripción genética incluyen elementos que actúan en cis (región codificante), factores que actúan en trans (factores que actúan en trans) y ARN polimerasa (ARN polimerasa).
Los elementos que actúan en cis se refieren a promotores y secuencias reguladoras de genes. Incluye principalmente promotores, potenciadores, silenciadores, etc. Los factores de acción trans se refieren a proteínas o ARN que pueden unirse a elementos de acción cis para regular la expresión genética. Los procariotas tienen una sola ARN polimerasa, mientras que los eucariotas tienen tres ARN polimerasas que catalizan la transcripción de diferentes productos de ARN. Dado que entre las tres ARN polimerasas en eucariotas, solo la ARN polimerasa II puede transcribir el precursor del ARN mensajero y traducirlo en productos proteicos de acuerdo con el principio del código triplete una vez que el procesamiento está maduro, aquí discutiremos principalmente la transcripción genética de la ARN polimerasa II. y su proceso regulatorio.
El promotor del gen eucariota consta de dos partes: el promotor central y el promotor aguas arriba. Es un grupo de funciones independientes dentro del sitio de inicio de la transcripción del gen (1) y su 5' aguas arriba, 100~200 pb, el ADN. La secuencia, cada elemento tiene de 7 a 20 pb de longitud, es un elemento clave que determina el sitio de inicio de la transcripción de la ARN polimerasa II y la frecuencia de la transcripción.
1. El promotor central se refiere a la secuencia mínima de ADN necesaria para asegurar el inicio normal de la transcripción de la ARN polimerasa II, incluido el sitio de inicio de la transcripción y la zona aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción -región TATA en 25~-. 30 pb. El promotor central, actuando solo, sólo puede determinar el sitio de inicio de la transcripción y producir un nivel basal de transcripción.
2. ¿Elemento promotor aguas arriba (UPE)? Incluyendo la región CAAT (CCAAT) y la región GC (GGGCGG), generalmente ubicadas cerca de -70 pb, que pueden regularse por el complejo TF Ⅱ D. Frecuencia de inicio de la transcripción y aumento. eficiencia de transcripción.
Incluye la secuencia completa de ADN desde el sitio de inicio de la transcripción hasta la terminación de la transcripción de la ARN polimerasa II.
La ARN polimerasa II es un tipo de proteína reguladora que puede unirse directa o indirectamente específicamente a la región TATA de la secuencia central del promotor e iniciar la transcripción. La ARN polimerasa II forma un complejo de iniciación de la transcripción con la ayuda de factores de transcripción. La ARN polimerasa II está compuesta por al menos de 10 a 12 subunidades. La masa molecular relativa de cada subunidad es 1X10^4~2,4X10^5. Algunas subunidades también se utilizan en la polimerasa I y III.
4. Los factores proteicos necesarios para la transcripción basal de la ARN polimerasa Ⅱ (representados por "TF Ⅱ"). En condiciones fisiológicas, los factores proteicos necesarios para la transcripción basal de la ARN polimerasa Ⅱ forman un complejo de iniciación de la transcripción. . TF Ⅱ D, TF Ⅱ B y TF Ⅱ F y la ARN polimerasa Ⅱ pueden formar el complejo más primario en el promotor para comenzar a transcribir el ARNm. Después de agregar TF Ⅱ E y TF Ⅱ H, se forma y transcribe un complejo de transcripción completo por mucho tiempo. ARN de cadena, agregar TF IIA puede mejorar aún más la eficiencia de la transcripción. Cuando la ARN polimerasa Ⅱ se desliza a lo largo de la plantilla, TF Ⅱ D y TF Ⅱ A permanecen en el sitio de inicio de la transcripción, y otros factores se mueven con la polimerasa hasta el extremo 3' del ADN plantilla. Actualmente existen dos hipótesis sobre cómo la ARN polimerasa II se integra en el complejo de iniciación de la transcripción y sus funciones. Una es una unión de un paso y la otra es una unión paso a paso.
Un potenciador se refiere a una secuencia de ADN que puede aumentar significativamente la frecuencia de transcripción de genes vinculados a ella.
Los promotores y potenciadores eucariotas están compuestos por varios elementos de la secuencia del ADN. Debido a que a menudo están unidos a genes funcionales específicos, se denominan elementos que actúan en cis. Estas secuencias constituyen la región reguladora de la transcripción genética y afectan la expresión genética. En el proceso de regulación transcripcional, además de la región reguladora, también se requieren factores de acción trans. Según sus diferentes funciones, los factores de acción trans a menudo se dividen en las siguientes tres categorías: factores de transcripción básicos con la función de reconocer elementos promotores; reguladores de la transcripción que pueden reconocer potenciadores o silenciadores y factores de transcripción que no requieren interacciones ADN-proteína. Factores regulatorios.
En los experimentos, los dos primeros tipos de factores de acción trans a menudo se denominan colectivamente factores de transcripción (TF), incluidos los activadores y represores transcripcionales. Este tipo de proteína reguladora puede reconocer y unirse a la secuencia aguas arriba o al elemento potenciador distal del sitio de inicio de la transcripción, regular la actividad de la transcripción a través de interacciones ADN-proteína y determinar la expresión específica en el tiempo y el espacio de diferentes genes.
***El regulador en sí no tiene actividad de unión al ADN y afecta principalmente a la conformación molecular de los factores de transcripción a través de interacciones proteína-proteína, regulando así la actividad de transcripción. En los experimentos, el tipo de reguladores transcripcionales que tienen efectos sinérgicos con los activadores transcripcionales a menudo se denominan activadores transcripcionales.
Todos los activadores transcripcionales pueden reconocer sitios objetivo (promotores, potenciadores), mientras se determina la especificidad del sitio objetivo. por la secuencia específica del dominio de unión al ADN. El dominio de unión al ADN se une a una secuencia específica, acercando así el dominio de activación transcripcional del activador a la región de transcripción basal.
En campos relacionados con la botánica, los investigadores científicos utilizan principios relevantes para construir vectores de transformación que contienen etiquetas inducibles. En primer lugar, diseñan promotores especiales para garantizar que los factores de transcripción fusionados (incluidos los dominios de unión al ADN, el dominio de activación de la transcripción y los dominios de activación de la transcripción) se fusionen. dominio regulador del receptor) se expresan constitutivamente. Una vez que se agrega una pequeña molécula química al experimento, la pequeña molécula se une al dominio regulador del receptor, lo que hace que el factor de transcripción expresado por fusión cambie su conformación y se mueva desde la matriz citoplasmática hacia el núcleo. La proteína de fusión puede reconocer y unirse específicamente al dominio de unión al ADN relevante, y el dominio de activación transcripcional de la proteína puede activar la expresión de alto nivel de genes relacionados. (En pocas palabras, es un factor de transcripción que tiene tres dominios: 1. Unión al ADN, 2. Unión a la ARN polimerasa, 3. Unión y regulación de algunos factores reguladores químicos.
Los factores de transcripción se activan después de agregar ciertas moléculas químicas pequeñas, activando así la expresión genética. )
Factores de transcripción: TF II D que reconoce la región TATA, CTF que reconoce la región CAAT, SP1 que reconoce GGGCGG y HSF que reconoce la región promotora de la proteína de choque térmico. Se sabe que cada celda puede contener alrededor de 60.000 SP1, mientras que el contenido de CTF llega a 300.000 por celda.
Los factores de acción trans son proteínas que pueden reconocer o unirse directa o indirectamente a las secuencias centrales de varios elementos que actúan en cis y participar en la regulación de la eficiencia de la transcripción de genes diana. Los dominios de unión al ADN comunes incluyen dominios de unión a aminoácidos básicos, dominios de activación ácida, dominios ricos en glutamina (Q), dominios ricos en prolina (P), etc. Normalmente, la mayoría de los receptores regulados por ligandos tienen un dominio de unión al ADN y un dominio de activación de la transcripción. Los receptores de esteroles suelen ser factores de transcripción con dominios de unión a ADN conservados en su extremo N y dominios de unión a hormonas en su extremo C.
1. Estructura hélice-giro-hélice (HTH) (esta estructura está diseñada para unir el ADN. Hay al menos dos hélices α en este tipo de molécula de proteína, con una hélice corta en el medio). Los residuos de aminoácidos de la cadena lateral forman un "giro" y la sustitución de residuos de aminoácidos en la hélice α cerca del extremo carboxilo afectará la unión de la proteína en el surco principal de la doble hélice del ADN. Las proteínas codificadas por genes homeobox, como el locus MAT que controla el tipo de apareamiento de la levadura y los genes reguladores del desarrollo de somitas de Drosophila (antp, ftz, ubx), tienen estructuras HTH. Al interactuar con el ADN, la primera y segunda hélice de la proteína del homeodominio tienden a estar cerca del exterior, y la tercera hélice se une al surco mayor del ADN y se une al surco menor del ADN a través de su brazo N-terminal adicional.
El homeodominio se refiere a un segmento de ADN que codifica 60 secuencias de aminoácidos conservadas. Está ampliamente presente en los genomas eucariotas desde que se descubrió por primera vez en los loci homeóticos de Drosophila (el producto genético de este locus genético determina el cuerpo). siendo clonados durante el desarrollo), los genes de conversión homóloga están estrechamente relacionados con el crecimiento, desarrollo y diferenciación de los organismos biológicos. Muchos genes que contienen regiones de conmutación homólogas tienen funciones reguladoras de la transcripción y es probable que las secuencias de aminoácidos de las regiones de conmutación homólogas participen en la formación de regiones de unión al ADN. A continuación se resumen las secuencias de ADN reconocidas por algunos factores de transcripción que contienen regiones de conmutación homólogas Oct-1, Oct-2 y la secuencia central reconocida por Pit-1/GHF-1 solo tienen una diferencia de bases, mientras que Drosophila en, ftz y ubx. Los productos genéticos pueden reconocer exactamente la misma secuencia de ADN. Además de reconocer la misma secuencia que el primero, el producto del gen eve también reconoce otra secuencia diana.
Oct-1 y Oct-2 se unen específicamente a la región de 8 bases en el promotor. Ambos contienen una región pou de 75 aminoácidos y una región de transición de homología de 60 aminoácidos. Aunque las homeoboxes en Oct-1 y Oct-2 son significativamente diferentes de la región de transición homóloga clásica de Drosophila (solo 20 de los 60 aminoácidos son idénticos, más 8 sustituciones conservadoras), esta región es diferente en estas dos proteínas. están altamente conservados (53 de los 60 aminoácidos son idénticos).
2. ¿Estructura de dedos de zinc? Las proteínas de la familia de estructuras de dedos de zinc se pueden dividir aproximadamente en dedos de zinc, giros de zinc y estructuras de grupos de zinc. Su cisteína única y el número de residuos de aminoácidos entre los residuos de histidina son. básicamente constante, y sólo cuando está involucrado el zinc tiene actividad reguladora transcripcional. La estructura repetitiva de dedos de zinc consta de una hélice α y una lámina β antiparalela en la base, centrada en el átomo de zinc, conectada por un enlace de coordinación entre un par de cisteína y un par de histidina que sobresalen lisina y arginina. en el anillo de zinc participan en la unión al ADN.
Cada hélice α en la estructura de los dedos de zinc puede reconocer específicamente de 3 a 4 bases. Utilizando las características de diferentes estructuras de dedos de zinc para reconocer secuencias de ADN específicas y el principio de que las nucleasas pueden cortar el ADN objetivo, los investigadores han obtenido un nuevo tipo de endonucleasa de restricción llamada nucleasa de dedos de zinc (nucleasa de dedos de zinc, ZFN).
Partiendo de la característica de que se pueden reconocer diferentes secuencias de ADN cambiando las siete secuencias X en la secuencia universal de las estructuras de dedos de zinc, se diseñaron artificialmente hélices α que reconocen secuencias de ADN específicas y se utilizó TGEK como secuencia de conexión entre las hélices para construir pares de dominios de dedos de zinc artificiales y la proteína de fusión Fok I (ZFN) pueden cortar las dobles hebras de ADN en una región designada.
3. Cremallera básica de leucina, es decir, estructura bZIP. Existe una gran clase de proteínas de la familia C/EBP en el hígado, el epitelio intestinal, los adipocitos y algunas células cerebrales. Se caracterizan por su capacidad para unirse a la región CCAAT y a los potenciadores virales. Los 35 residuos de aminoácidos en el extremo carboxilo de la proteína de la familia C/EBP tienen la característica de formar una hélice α. Hay un residuo de leucina cada 6 aminoácidos, lo que hace que aparezca el séptimo residuo de leucina en la hélice. la misma dirección.
4. Basic-helix-loop-helix (basic-helix/loop/helix), es decir, la estructura bHLH se encuentra en las proteínas de unión al potenciador E12 y E47 del gen de la cadena ligera kappa de la inmunoglobulina. , en el extremo carboxilo terminal, entre 100 y 288 residuos de aminoácidos pueden formar dos hélices α anfipáticas, separadas por una estructura de anillo no helicoidal.
Dominio de activación de la transcripción
En eucariotas. Las funciones de los factores de acción trans están intrincadamente reguladas por interacciones proteína-proteína, y las funciones reguladoras transcripcionales completas generalmente se logran en forma de complejos, lo que significa que no todos los factores de transcripción se unen directamente al ADN. Por lo tanto, si tiene un dominio de activación de la transcripción se convierte en la única base estructural para los factores que actúan en trans. Las funciones de los factores que actúan en trans son diversas y sus dominios de activación transcripcional también lo son, y generalmente dependen de 30 a 100 residuos de aminoácidos fuera del dominio de unión al ADN. Los diferentes dominios de activación de la transcripción generalmente tienen las siguientes estructuras características:
1. Estructura helicoidal cargada negativamente
2. Estructura rica en glutamina
3. Estructura rica en prolina
Utilizando el principio de interacción entre elementos que actúan en cis y factores que actúan en trans, los investigadores han desarrollado muchas tecnologías para regular la expresión genética. Entre ellas, la última aplicación es la tecnología TALEN (TALEN = proteína de fusión de nucleasa FokI efectora similar al activador de la transcripción), que utiliza los aminoácidos 12 y 13 en el segmento peptídico repetido de 34 aminoácidos del activador de la transcripción para reconocer específicamente las bases del ADN. , sintetiza en tándem proteínas TALE que pueden reconocer la secuencia de bases objetivo, y se fusiona y expresa con la endonucleasa FokI, que puede cortar de 9 a 13 pb corriente abajo de la secuencia de reconocimiento específica, logrando así la función de eliminar el gen endógeno designado.
En eucariotas, el ajuste estructural a nivel de cromatina que se produce antes de la transcripción se denomina regulación epigenética de la expresión génica. Incluye principalmente dos aspectos: modificación del ADN (metilación del ADN) y modificación de histonas (acetilación, metilación de histonas).
Las últimas investigaciones en biología molecular muestran que durante el desarrollo individual, la plantilla de ADN utilizada para sintetizar el ARN también cambia regularmente, regulando así la expresión genética y el desarrollo de los organismos.
La formación de genes altamente repetitivos suele estar relacionada con ciertos cambios en el ADN durante la etapa de diferenciación de los individuos. Por ejemplo, un glóbulo rojo maduro produce grandes cantidades de ARNm que se traduce en globina madura, mientras que sus células precursoras no producen globina. En muchos casos, este cambio se debe a un cambio permanente en el propio gen o en su número de copias. Este tipo de regulación a nivel del ADN es una forma de regulación del desarrollo eucariota, que incluye pérdida, amplificación, reordenamiento y translocación de genes, mediante la cual ciertos genes pueden eliminarse o transformarse y cambiar su actividad. Estos modos de regulación provocan cambios en el genoma, que son diferentes de la regulación a nivel de transcripción y traducción.
1. El impacto de la estructura de cromatina activa "abierta" en la transcripción. La transcripción activa de genes eucariotas se produce en la eucromatina.
Antes de que se produzca la transcripción, la cromatina suele desenrollarse y relajarse en regiones específicas para formar ADN libre. Dichos cambios pueden incluir la eliminación o cambio de la estructura del nucleosoma, cambios en la estructura local del propio ADN o incluso cambios de hélice derecha a hélice izquierda (ADN-Z). Estos cambios pueden conducir a la exposición de genes estructurales. y promover la interacción entre los factores de transcripción y la iniciación de la unión al ADN que induce la transcripción de genes. . Cuando se utilizó la DNasa I para tratar la cromatina de varios tejidos, se descubrió que la DNasa I degradaba más fácilmente el ADN en estado activo.
Los estudios han encontrado que la cromatina de genes expresados activamente generalmente contiene uno o varios sitios hipersensibles a la ADNasa I (sitios hipersensibles, la mayoría de ellos están ubicados en la región promotora del extremo 5' del gen, y unos pocos). están ubicados en otras localidades. El sitio correspondiente en el extremo 5' del gen inactivo no muestra hipersensibilidad a la ADNasa I. Alguien utilizó la nucleasa SI, que corta específicamente el ADN monocatenario, para tratar el ADN cromosómico donde el gen se expresa activamente. Se confirmó que el ADN se hidrolizó, lo que indica que cuando el gen se expresa activamente, parte de la secuencia está en el promotor. La región promotora puede desenredarse en una sola hebra, de modo que no puede continuar envolviéndose alrededor del nucleosoma. En la superficie, el ADN de la región promotora queda "descubierto" en la superficie de la histona, formándose un fenómeno de hipersensibilidad a la ADNasa I. La explicación anterior en tiempo real muestra que la generación de sitios hipersensibles puede ser el resultado de cambios regulares en la estructura de la cromatina. Es precisamente debido a este cambio que el ADN se combina fácilmente con la ARN polimerasa y otros factores reguladores de la transcripción para iniciar la expresión genética, y también es más fácil degradar por las nucleasas.
Existe evidencia de que la existencia de estructuras circulares en forma de "cepillo de lámpara" en los cromosomas puede estar relacionada con la transcripción activa de genes.
2. Amplificación genética
La amplificación genética se refiere al fenómeno de un aumento específico y grande en el número de copias de ciertos genes que hace que las células produzcan una gran cantidad de productos genéticos. un corto período de tiempo. Satisfacer las necesidades de crecimiento y desarrollo es una forma de regular la actividad genética.
3. Reordenamiento y transformación de genes
Mover un gen desde una ubicación alejada del promotor a una ubicación muy cercana a él para iniciar la transcripción se denomina reordenamiento genético. . . O se conectan varios fragmentos de genes distantes mediante recombinación de ADN intracromosómico para producir proteínas con actividad expresada.
La metilación del ADN es una de las primeras vías de modificación descubiertas. Esta vía de modificación puede existir en todos los organismos superiores y está estrechamente relacionada con la regulación de la expresión génica. Un gran número de estudios han demostrado que la metilación de DMA puede detener la actividad de ciertos genes, mientras que la desmetilación induce la reactivación y expresión de genes. La metilación del ADN puede provocar cambios en la estructura de la cromatina, la conformación del ADN, la estabilidad del ADN y la interacción entre el ADN y las proteínas, regulando así la expresión genética. Los estudios han confirmado que la metilación de la citosina en los dinucleótidos CpG causa más de 1/3 de las enfermedades genéticas causadas por la conversión de bases en el cuerpo humano.
1. Metilación del ADN
El fenómeno de modificación de la metilación del ADN existe ampliamente en una variedad de organismos. A nivel cromosómico, los niveles de metilación del ADN son más altos cerca de los centrómeros; a nivel genético, las regiones de metilación del ADN de alto nivel cubren la mayoría de los transposones, pseudogenes y pequeñas regiones codificantes de ARN. La metilación parece tener una fuerte capacidad de control transcripcional para genes cortos, pero una capacidad de control muy débil para genes largos. Los experimentos han demostrado que este proceso no solo está relacionado con el posicionamiento del inicio de la replicación del ADN y la corrección de errores, sino que también participa en la regulación del crecimiento celular, el desarrollo, la impresión cromosómica, la inactivación del cromosoma X, etc., mediante el cambio de la expresión genética. La metilación del ADN forma principalmente 5-metilcitosina (5-mC) y una pequeña cantidad de N6-metiladenina (N6-mA, aquí 6 es un superíndice) y 7-metilguanina (7-mG). En eucariotas, la 5-metilcitosina se produce principalmente en las secuencias CpG CpXpG, CCA/TGG y GATC. Debido a que la C en las secuencias de dinucleótidos CpG de organismos superiores suele estar metilada y se desamina fácilmente de forma espontánea para generar timina, la frecuencia de las secuencias de dinucleótidos CpG es mucho menor que la calculada en función de la composición de nucleótidos.
Debido a que estos dinucleótidos CpG suelen aparecer en grupos en el ADN, esta secuencia a menudo se denomina isla CpG.
Hay dos actividades de metilasa en las células eucariotas: una se llama metiltransferasa diaria y la otra es metiltransferasa sintética de novo. La primera se sintetiza principalmente en casa bajo la guía de la hebra madre (hebra plantilla). , la citosina correspondiente a la metilcitosina en la molécula de doble cadena de ADN metilado está metilada. La enzima tiene una especificidad catalítica extremadamente fuerte y es más eficaz para el ADN hemimetilado. La alta afinidad hace que el ADN hemimetilado naciente se metatile rápidamente, asegurando así el patrón de metilación. permanece sin cambios después de la replicación del ADN y la división celular. Este último cataliza el CpG no metilado en mCpG. No requiere guía de la cadena principal, pero la velocidad es muy lenta. Este tipo de metilasa es el principal factor que hace que genes específicos sean regulados por metilación, y juega un papel muy importante en el estudio de los cambios epigenéticos en la expresión génica.
2. El mecanismo por el cual la metilación del ADN inhibe la transcripción genética
La metilación del ADN provoca cambios conformacionales en determinadas regiones, afectando así a la interacción entre las proteínas y el ADN e inhibiendo la eficiencia de unión. factores al ADN promotor. Los estudios han demostrado que cuando la histona H1 forma complejos con ADN metilado o no metilado que contiene secuencias CCGG, existen grandes diferencias en la configuración del ADN. Cuando la metilación alcanza un cierto nivel, cambiará de la transición B convencional del ADN al ADN Z. . A medida que la estructura del ADN Z se contrae y la hélice se profundiza, muchos elementos a los que se unen los factores proteicos se contraen hacia el surco principal, lo que no favorece el inicio de la transcripción genética. Las personas utilizaron ADN con la misma secuencia pero diferentes niveles de metilación como materiales para comparar sus actividades como plantillas de transcripción de la ARN polimerasa. Se descubrió que la introducción de grupos metilo no conducía a la unión de las plantillas a la ARN polimerasa, reduciendo así su transcripción in vitro. actividad.
La 5-metilcitosina no se distribuye aleatoriamente en el ADN. Los extremos 5' y 3' de los genes suelen ser ricos en sitios de metilación, y la densidad de metilación en las moléculas de ADN en la región promotora está relacionada con el grado de la inhibición de la transcripción genética está estrechamente relacionada. Una rara metilación de un promotor débil puede inactivar completamente su actividad transcripcional. Cuando se potencia este tipo de promotor (con un potenciador), su actividad transcripcional se puede restaurar incluso sin desmetilación. Si la densidad de metilación aumenta aún más, incluso el promotor mejorado seguirá sin tener actividad transcripcional. Debido a que la intensidad de la inhibición de la transcripción por metilación se correlaciona positivamente con la capacidad de MeCP1 (proteína 1 de unión a metil CpG) para unirse al ADN, el equilibrio entre la densidad de CpG metilado y la fuerza del promotor determina si el promotor es transcripcionalmente activo.
La metilación del ADN también aumenta la frecuencia de mutaciones en este sitio.
3. Metilación del ADN e inactivación del cromosoma X
La inactivación del cromosoma X es un mecanismo regulador único durante el desarrollo. Uno de los dos cromosomas X en las hembras de mamíferos vivíparos se inactiva aleatoriamente en las primeras etapas del desarrollo para garantizar la misma dosis de genes del cromosoma X que en los machos con un solo cromosoma X.
El impacto de la acetilación de histonas en la expresión genética:
1. La composición básica de las histonas: las histonas son los componentes básicos de los nucleosomas, y los nucleosomas (nucleosoma) es la unidad estructural básica de cromatina. Los nucleosomas están compuestos por un octámero de histonas (que consta de dos tetrámeros que contienen H2A, H2B, H3 y H4) y ADN envuelto dos veces. Hay un espaciador de 20 a 200 pb entre los nucleosomas adyacentes. Bajo un microscopio electrónico, una fila de nucleosomas parece una cadena de cuentas y el diámetro de cada cuenta es de aproximadamente 10 nm. Otra histona H1 se une fuera del núcleo del nucleosoma y desempeña un papel en la estabilización de la secuencia del nucleosoma y la estructura de orden superior de la cromatina.
2. Acetilación y desacetilación de histonas centrales
La parte N-terminal de las histonas centrales que mira hacia el exterior se llama "cola", y puede ser utilizada por las histonas acetiltransferasas y la modificación de la desacetiltransferasa. , añadiendo o eliminando grupos acetilo. La siguiente imagen muestra los principales sitios modificados de la "cola" N-terminal de las histonas que se han informado.
3. Histona acetiltransferasa
La histona acetiltransferasa (HAT) cataliza la reacción de acetilación de las histonas. Hay dos tipos principales de HAT descubiertos hasta ahora: uno está relacionado con la transcripción y el otro está relacionado con el ensamblaje de nucleosomas y la estructura de la cromatina. HAT no es una proteína de unión a la cromatina, pero puede afectar la estructura de la cromatina al interactuar con otras proteínas. Muchos activadores transcripcionales tienen actividad HAT. La subunidad catalítica HAT relacionada con la transcripción es un homólogo de la proteína reguladora de levadura GCN5, y el propio GCN5 tiene la actividad de acetilar las histonas H3 y H4.
La histona acetiltransferasa TAF Ⅱ 250 es una subunidad del complejo TF Ⅱ D. Su función principal es unirse al promotor para ayudar en el inicio de la transcripción, pudiendo acetilar las histonas H3 y H4. El activador del factor de transcripción PCAF también puede acetilar estas dos histonas. La histona acetiltransferasa p300/CBP también es un activador del factor de transcripción. Regula la transcripción al interactuar con proteínas de unión a potenciadores y puede acetilar las histonas H2A, H2B, H3 y H4. ACTR, un activador de la transcripción que coopera con los receptores hormonales, es también una histona acetiltransferasa que actúa sobre H3 y H4.
4. Desacetilación de histonas
La histona desacetilasa (HDAC) es responsable de eliminar los grupos acetilo de las histonas. La investigación actual es más profunda en humanos y Rpd3 en levaduras. Tanto HDAC como Rpd3 forman grandes complejos proteicos para funcionar. Rpd3 puede eliminar específicamente los grupos acetilo de las histonas, acercar los nucleosomas entre sí e inhibir la transcripción genética bajo la acción sinérgica de los represores del factor de transcripción Sin3 y R.
5. El impacto de la acetilación y desacetilación de histonas en la expresión génica
La histona acetiltransferasa y la desacetilasa afectan la acetilación y desacetilación de histonas por efectos sobre la expresión génica. La acetilación de residuos de lisina en la "cola" N-terminal de las histonas neutraliza la carga positiva de la cola de histona, reduciendo su afinidad con el ADN, lo que da como resultado una conformación de nucleosoma que favorece la interacción entre las proteínas reguladoras de la transcripción y la cromatina. Los cambios combinados resultan en una mayor actividad de transcripción genética.
Regulación de la expresión de genes eucariotas mediante metilación de histonas
El silenciamiento génico (también conocido como silenciamiento de ARN) se refiere al reconocimiento inducido por el ARN bicatenario en eucariotas y a un mecanismo para eliminar el ARN anormal. de las células. Generalmente, el silenciamiento génico se puede dividir en silenciamiento génico transcripcional y silenciamiento génico postranscripcional. La interferencia por ARN (ARNi) se refiere a la tecnología de silenciamiento génico de doble cadena para la degradación eficiente y específica del ARNm homólogo inducida por ARN. (ARN bicatenario, ARNds). Debido a que la tecnología de ARNi puede reducir o inhibir específicamente la expresión de genes diana, esta tecnología se ha utilizado ampliamente en el campo de la terapia génica para explorar funciones y enfermedades genéticas.
1. ARN de interferencia pequeño (ARNip):
Los experimentos han demostrado que la eficiencia de interferencia del ARN bicatenario en la expresión de genes endógenos es mucho mayor que la del ARN monocatenario. Debería ser ARN bicatenario el que desempeñe el papel de silenciador de ARN. Además, el estudio también encontró que el ARN exógeno introducido solo tenía una alta eficiencia de silenciamiento para genes homólogos, lo que sugiere que es posible que necesiten formar una base para el emparejamiento. En 2000, la investigación de RNAi logró avances importantes, revelando muchas características importantes del fenómeno RNAi mediado por dsRNA.
Los investigadores desarrollaron un sistema de investigación de ARNi in vitro basado en extractos de células de Drosophila y descubrieron que, independientemente de si hay un ARNm objetivo, las cadenas sentido y antisentido del ARNbc exógeno introducido se cortarán en pequeños fragmentos de 21 a 23 nt. El ARNm objetivo también se degradará en fragmentos con una diferencia de longitud de 21 a 23 nt, lo que indica que es probable que esta degradación esté mediada por pequeños fragmentos de 21 a 23 nt, y esta degradación requiere ATP para proporcionar energía. Ahora, los pequeños fragmentos de ARN que median en este fenómeno de silenciamiento se han denominado uniformemente ARN pequeño de interferencia (ARNip).
2. Biosíntesis de ARNip
El ARN viral y el ARN exógeno introducido por factores ambientales y experimentales pueden ser fuentes de ARNip. Además, las repeticiones genómicas, los transposones y otras secuencias también pueden producir ARNip. Por lo general, un ARN pequeño de doble hebra tiene 21 nt de largo, de los cuales 19 nt forman una doble hebra pareada, con dos secuencias de nucleótidos no apareadas en el extremo 3' y un grupo fosfato en el extremo 5'. Una cadena es la cadena guía, que media en la degradación del ARNm; la otra cadena es la cadena pasajera, que se degrada antes de que el ARNip forme un complejo funcional.
El proceso de producción de ARNip incluye principalmente tres pasos principales: 1. Escisión en Dicer para formar pequeños fragmentos bicatenarios
2. Ensamblaje de complejos
; 3. Formar un complejo silenciador activo (complejo silenciador inducido por ARN, RISC)
(1) ¿Escisión de Dicer? Dicer es un tipo de proteína RNasa III, que incluye principalmente un par de dominios de RNasa III, de doble cadena. Dominio de unión a ARN, dominio helicasa y dominio PAZ. El dominio PAZ puede unirse a los dos nucleótidos desapareados 3' del ARN bicatenario. Los dos dominios de RNasa III forman una estructura de dímero intramolecular y cada uno cataliza el corte de una hebra, lo que produce roturas de doble hebra. Los estudios de biología estructural han demostrado que el dominio PAZ y el punto de corte catalítico de la RNasa III están separados por aproximadamente 6,5 nm, lo que equivale a una longitud de más de 20 nucleótidos. Por lo tanto, el propio Dicer se puede utilizar como regla de corte para cortar 21-. nm ~23nt ARNip.
(2) Ensamblaje de R2D2? La carga de siRNA requiere la ayuda de la proteína de unión a ARN bicatenario R2D2. R2D2 contiene dos dominios de unión de ARN bicatenario en tándem. Se informa que R2D2 puede unirse al extremo térmicamente más estable del ARN pequeño bicatenario.
(3) ¿Ensamblaje y maduración de RISC?
. . .
miARN
Otros niveles de regulación de la expresión de genes eucarióticos
Regulación de la transcripción génica mediante fosforilación de proteínas